生物發(fā)光是某些生物的一種生理現(xiàn)象，海洋生物中更為多見。自1672年R．Boyle觀察到發(fā)光的菌體所發(fā)出的光易被化學物質(zhì)抑制后，許多科學家相繼對細菌的發(fā)光效應(yīng)進行了大量的研究。本世紀70年代至80年代初，國外科學家首次從海魚體表分離和篩選出對人體無害，對環(huán)境敏感的發(fā)光細菌，用于檢測水體生物毒性，現(xiàn)已成為一種簡單、快速的生物毒性檢測手段。80年代初我國引進了這項技術(shù)，并先后分離出海水型和淡水型的發(fā)光細菌，用以檢測環(huán)境污染物的急性生物毒性；近年來還分離出明亮發(fā)光桿菌暗變種檢測環(huán)境污染物致突變性，擴大了檢測范圍。
一、發(fā)光細菌檢測的原理與操作
（一）基本原理
發(fā)光菌檢測法是以一種非致病的明亮發(fā)光桿菌作指示生物，以其發(fā)光強度的變化為指標，測定環(huán)境中有害有毒物質(zhì)的生物毒性的一種方法。
細菌的發(fā)光過程是菌體內(nèi)一種新陳代謝的生理過程，是光呼吸進程，是呼吸鏈上的一個側(cè)支，即菌體是借助活體細胞內(nèi)具有ATP、螢光素（FMN）和螢光素酶發(fā)光的。綜合化學反應(yīng)過程為：
該光波長在490nm左右。這種發(fā)光過程極易受到外界條件的影響。凡是干擾或損害細菌呼吸或生理過程的任何因素都能使細菌發(fā)光強度發(fā)生變化。當有毒有害物質(zhì)與發(fā)光菌接觸時，發(fā)光強度立即改變，并隨著毒物濃度的增加而發(fā)光減弱。這種發(fā)光強度的變化，可用一種精密測光儀定量地測定。美國Microbics公司設(shè)計制造了一套微毒測定儀器。國內(nèi)中國科學院南京土壤研究所，華東師范大學生物系也分別成功地研制了DXY－2型和SDJ－1型的生物發(fā)光光度計（生物毒性測試儀）。
（二）典型操作
1．典型操作方法 目前國內(nèi)外細菌發(fā)光的測定常用的有二種方法。
（1）新鮮發(fā)光細菌培養(yǎng)測定法 即將發(fā)光菌接種于液體培養(yǎng)基中，在適當條件下（20℃±0.5℃）振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期，配制為含3％NaCl鹽度的適當濃度的菌懸液加入測試管中，再加入待測液，使之和菌種接觸，作用5min～15min后，讀出井記錄對照管和樣品管發(fā)光強度。此法操作較為簡便。
（2）冷凍干燥發(fā)光細菌制劑測定法，把培養(yǎng)到對數(shù)生長期的發(fā)光細菌，以冷凍干燥法制成凍干粉劑，使用時加入冷的2％NaCl溶液復(fù)蘇，使其恢復(fù)到原來的生理狀態(tài)和發(fā)光水平，然后用于測定。這是國家標準方法，其優(yōu)點是可實行測定的質(zhì)量控制。凍干粉可長期保藏方便使用，操作簡便，節(jié)約時間。
2．試劑與材料
（1）測試菌種 明亮發(fā)光桿菌（Ptotobacterium phosphoreum）T3小種。
①新鮮明亮發(fā)光桿菌懸浮液。
②或明亮發(fā)光桿菌凍干粉（800萬Cell／g）。
（2）培養(yǎng)基
①液體培養(yǎng)基 酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl30.0g，Na2HPO45.0g，KH2PO41.0g，甘油3.0g加蒸餾水至1000ml。pH7.0±0.5。
②固體培養(yǎng)基 培養(yǎng)液（按上述配方）1000ml，瓊脂169g，pH7.0±0.5。
（3）稀釋液 3％NaCl，2％NaCl。
（4）參比毒物 0.02mg／L～0.24mg／L的HgC12系列標準溶液。
（5）儀器與器材
①DXY－2型生物發(fā)光光度計（中國科學院南京土壤研究所研制）及2ml或5ml比色管。
②恒溫振蕩器，培養(yǎng)箱，手提式高壓消毒鍋。
③10ul或20ul微量加液器，1ml注射器，移液器，容量瓶，三角瓶。
（6）檢測樣品 視實驗?zāi)康亩ā?/p>
二、發(fā)光細菌法的應(yīng)用
根據(jù)發(fā)光細菌法的原理和方法，凡能干擾或破壞發(fā)光細菌呼吸、生長、新陳代謝等生理過程的環(huán)境因子，例如有毒有害的物質(zhì)等都可以運用發(fā)光細菌法檢測生物毒性。其主要應(yīng)用包括：
1．發(fā)光細菌對水、土、氣中化合物的急性毒性評價及快速評價水源水和地面水的質(zhì)量，漁業(yè)水體，農(nóng)田灌溉水體等的檢測。
2．工業(yè)廢水，廢氣和固體廢棄物的急性毒性與評價，及污染源的毒性追蹤與判斷，河流流經(jīng)地域的排污分擔率的估算，污水合格排放的稀釋率的推算與評定。
3．土壤重金屬急性毒性效應(yīng)測定和評價，土壤金屬毒性的協(xié)同或拮抗效應(yīng)監(jiān)測。
4．化學品的毒性評價與安全性評定，化學危險品的風險評定，以及環(huán)境污染物的致突變性的評價。
5．環(huán)境保護處理設(shè)施效果的監(jiān)控。隨著環(huán)境學科的發(fā)展，發(fā)光細菌法的應(yīng)用范圍和前景將愈來愈寬廣。
三、發(fā)光細菌法測定急性毒性的操作程序
（一）發(fā)光細菌新鮮菌懸液的制備（第1法）
1．斜面菌種培養(yǎng) 于測定前48h取保存菌種，于新鮮斜面上接出第一代斜面，20℃±0.5℃培養(yǎng)24h后立即轉(zhuǎn)接第二代斜面，20℃±0.5℃培養(yǎng)24h，再接出第三代斜面20℃±0.5℃培養(yǎng)12h后備用。每次接種量不超過一接種耳。
2．搖瓶菌液培養(yǎng) 取第三代斜面菌種近一環(huán)，接種于裝有50ml培養(yǎng)液的250ml三角瓶內(nèi)，20℃±0.5℃，184rpm／min下培養(yǎng)12h－14h備用。
3．將培養(yǎng)液稀釋至每毫升108個細胞～109個細胞，初始發(fā)光度不低于800mV，置水浴中備用。
（二）菌液復(fù)蘇（第2法）
取冷藏的發(fā)光菌凍干粉，置冰浴中，加入0.5ml冷的2％NaCl溶液，充分搖勻，復(fù)蘇2min，使其具有微微綠光，初始發(fā)光度不低于800mV。
（三）樣品采集與處理
1．水樣
（1）從不同工業(yè)廢水的各排放口，每4h采樣一次，連續(xù)采集24h后，均勻混合后備用。
（2）納污水體 取其入口，中心，出口三個斷面混合水樣備用。
（3）以同上方法采集清潔水，作空白對照。
濁度大的污水，需靜置后取上清液。一般樣品不需加任何處理。水樣按3％比例投加NaCl置冰箱備用。
2．氣體樣品 以大氣采樣法取大氣樣品于氣體吸收液中吸收5ml，按3％比例投加NaCl，置冰箱備用，同法收集清潔空氣作為對照組。
3．固體樣品 取固體廢棄物，按《工業(yè)固體廢物有害特性試驗與監(jiān)測分析方法》制備浸出液，以取上清液，按3％比例投加NaCl，置冰箱備用。
（四）試驗濃度的選擇
在預(yù)備試驗的濃度范圍內(nèi)，按等對數(shù)間距或百分濃度取3個～5個試驗濃度，同時設(shè)空白對照和參比毒物系列濃度組。
（五）發(fā)光細菌法生物毒性測定
1．工業(yè)廢水或有毒物質(zhì)的生物毒性測定
（1）發(fā)光菌懸液初始發(fā)光度測定取4.9ml3％NaCl溶液于比色管內(nèi)，加新鮮發(fā)光菌懸液或凍干粉復(fù)蘇菌懸液10ul，若測量發(fā)光度在800mv以上，允許置冰浴中備用。
（2）取已處理待測廢水樣品，按等對數(shù)間距或百分濃度編號，并注明采集點。
（3）按表依次加入稀釋液，待測水樣及參比毒物系列濃度溶液。
（4）打開生物毒性測試儀電源，預(yù)熱15min調(diào)零點，備用。
（5）每管加入菌懸液0.01ml，準確作用5min或15min，依次測定其發(fā)光強度，記錄毫伏數(shù)。
每個濃度設(shè)三管重復(fù)。
2．工業(yè)廢氣（或有害氣體）的生物毒性測定
（1）氣體直接通入法 用注射器直接注入氣體于菌懸液中，經(jīng)10min～20min測定發(fā)光菌光強度的變化。
（2）氣體吸收法 方法同工業(yè)廢水測定法。
（3）固體菌落法 挑選固態(tài)培養(yǎng)到對數(shù)生長期的發(fā)光菌單茵落，連同培養(yǎng)基切下，置比色管內(nèi)，測定初始發(fā)光強度，然后用注射器將待測氣體注入菌苔表面，經(jīng)10min～20min后，測定發(fā)光度的變化。
（六）實驗結(jié)果處理與評價
1．記錄工業(yè)廢水，廢氣的生物毒性實驗數(shù)據(jù)及其計算。
（1）相對發(fā)光率或相對抑光率
計算公式：
（2）EC50值 在半對數(shù)座標紙上，以橫座標為對數(shù)濃度，以縱座標為相對抑或發(fā)光率，作圖，求得EC50值。
2．數(shù)據(jù)處理與評價
（1）建立相對抑光率與參比毒物系列濃度的回歸方程，求出樣品的生物毒性相當于參比毒性的水平，以評價待測樣品的生物毒性。
（2）以EC50值評定樣品的生物毒性水平 總之發(fā)光細菌法是檢測環(huán)境生物毒性的一種好方法，它具有快速、簡便、靈敏